基本原理：本文分離單核細(xì)胞所用方法是Percoll非連續(xù)性密度梯度離心法，主要是根據(jù)不同細(xì)胞間密度的差別進(jìn)行細(xì)胞分離。此法易操作，且使用通常的實(shí)驗(yàn)設(shè)備即可完成。

試劑與器材

1）外周血單個(gè)核細(xì)胞

2）1×PBS和10×PBS（無Ca2+、Mg2+，0.5mM EDTA），胎牛血清（56℃，30分鐘加熱滅活），HCl1mol/L。

Percoll分層液（密度=1.130g/ml,商品），4g/L臺盼藍(lán)染液（溶解在PBS液中）。

3）50ml聚丙烯圓錐管，毛細(xì)吸管，移液管（1、2、10ml）。

4）CO2孵箱，超凈臺，有旋轉(zhuǎn)桶轉(zhuǎn)子裝置的離心機(jī)，PH計(jì)。

操作步驟——所有的操作應(yīng)該在無菌條件下進(jìn)行

（一）不同密度Percoll分層液的配制

1.Percoll分層液儲備液的制備：取未稀釋的Percoll原液（從瓶中取）9ml+1ml 10×PBS（無Ca2+、Mg2+），用HCl 調(diào)節(jié)PH至7.4

2. Percoll分層液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll儲備液3.12 ml（前一步配制）+1.88ml 1× PBS1（無Ca2+、Mg2+）

3. Percoll分層液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml1×PBS（ 無Ca2+、Mg2+）

4. Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml1×PBS（無Ca2+、Mg2+）

（二）不連續(xù)密度梯度制備

1.將洗滌過的8×107外周血單個(gè)核細(xì)胞重新懸浮在2ml的Percoll分層液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在這層液體的表面上輕輕鋪上2mlPercoll分層液（Ⅱ）（密=1.069g/ml），后再于第二層液面上輕輕鋪上2ml的Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）

2. 20℃，在旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子中1000×g離心上步所形成的密度梯度90分鐘（慢慢增加速度，無制動(dòng)停轉(zhuǎn)）。

（三）單核細(xì)胞的分離

1. 離心后單核細(xì)胞存在于Percoll分層液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度較小的部分）之間的界面中。

2. 用毛細(xì)吸管仔細(xì)收集單核細(xì)胞。

3. 用含1-5%胎牛血清的 1×PBS液洗滌細(xì)胞3次，4℃，400×g離心5分鐘，棄上清液。

4. 若需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)基中。

5. 用臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞存活率。

結(jié)果：本法回收的細(xì)胞中單核細(xì)胞占70-100%（存活率應(yīng)大于90%），淋巴細(xì)胞占0-20%，粒細(xì)胞占0-5%，紅細(xì)胞占0-7%，血小板小于0.5%。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

1.為了得到較好的結(jié)果，外周血單個(gè)核細(xì)胞分離后應(yīng)立即使用。

2.所有操作過程應(yīng)在18-20℃中進(jìn)行。

3.仔細(xì)覆蓋各種Percoll分層液，避免破壞其界面。

4.洗滌分離細(xì)胞3次，以除去殘存的Percoll分層液和血小板。

5.如果所制備的細(xì)胞仍不純，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗體分子的磁珠，以除去殘存的NK、T、B淋巴細(xì)胞。